Venne istituito da Francesco Bonafede nel 1545 come Giardino dei semplici, stazione di acclimatazione e studio delle essenze di possibile utilizzo farmacologico. È l'orto botanico universitario più antico del mondo e mantiene l'originaria impostazione con un ampio recinto circolare in muratura con inscritto un quadrato attraversato da un cardo e un decumano a limitare quattro settori entro i quali sono ordinate, in ordine sistematico, numerose specie prevalentemente perenni. La realizzazione del complesso si protrasse per lunghi anni: dopo le prime sistemazioni cinquecentesche, attorno al 1700 la Repubblica di Venezia fece bonificare l'area predisponendo un innalzamento del terreno; nello stesso periodo furono realizzati portali d'ingresso decorati e incrementato il numero di serre. A inizio Ottocento si cominciò a introdurre esemplari di flora tropicale. Oggi al di fuori del recinto si trovano le serre e l'arboreto; particolarmente interessanti sono le collezioni di piante carnivore, piante acquatiche, felci e orchidee. L'orto raccoglie anche specie del territorio in via d'estinzione, che vengono studiate per garantirne la sopravvivenza. Per la sua eccezionale stratificazione e per la storia secolare, dal 1997 l'Orto Botanico è incluso tra i siti patrimonio mondiale dell'Unesco.