L'Orto Botanico è localizzato all'interno della cinta muraria della città di Siena, su una superficie in declivio di oltre due ettari. La nascita come «Giardino dei semplici» nel 1588 presso S. Maria della Scala, poi il trasferimento nel 1856 presso l'Accademia dei Fisiocritici (la sede attuale), quindi la trasformazione in Orto Botanico dell'Università, hanno arricchito tale spazio espositivo di un'ampia varietà di piante e di ambienti. L'origine antica dell'Orto si nota sia nella presenza di varie strutture architettoniche medievali, che nella disposizione delle piante nei tre settori principali. L'esposizione favorevole permette di conservare specie vegetali di vario genere: da quelle più termofile come la palma nana, a quelle montane, come il faggio e varie specie di abete. Su prenotazione è possibile visitare e consultare l'Erbario (Herbarium Universitatis Senensis), che ospita collezioni storiche e moderne di piante essiccate.