Inaugurato nel 2001, è allestito nei chiostri di S. Eustorgio e raccoglie pitture, sculture, paramenti e arredi sacri dal quarto secolo fino al ’900, preziose testimonianze dell’identità culturale e artistica della diocesi ambrosiana. Le opere provengono per lo più dalla Quadreria arcivescovile, dalle chiese della diocesi, in particolare da S. Ambrogio e da S. Maria della Passione, nonché da donazioni private (collezioni Marcenaro, Monti, Pozzobonelli, Visconti, Erba Odescalchi). Si segnalano in particolare la collezione dei ‘fondi oro’ tre e quattrocenteschi, tavole prevalentemente provenienti dalla Toscana (Nardo di Cione, Agnolo Gaddi, Taddeo di Bartolo, Sano di Pietro, Bernardo Daddi); il tondo di terracotta dipinta (bottega lombarda del decimo secolo), proveniente dalla basilica di S. Ambrogio, che secondo la tradizione riprende le reali fattezze del santo; il trittico di S. Caterina d’Alessandria e donatore del Bergognone; una cinquecentesca croce astile, di fattura lombarda, in argento fuso, sbalzato e bulinato; una grande ancona della Passione realizzata da una bottega di Anversa nella seconda metà del ’500, spettacolare architettura in legno intagliato, dorato e dipinto; un Salvator Mundi di Bernardino Lanino; un Giacobbe che lotta con l’angelo del Morazzone; la Salomè di Bernardino Campi, dai colori brillanti come smalto; il Furto sacrilego del Magnasco; una Pietà di Giulio Cesare Procaccini; la Caduta di S. Paolo e un S. Carlo in gloria del Cerano; un Cristo e l’adultera del giovane Tintoretto; alcuni paesaggi arcadici di Francesco Zuccarelli; un Crocifisso con Maddalena genuflessa e piangente di Hayez; gli affreschi strappati di una Via Crucis (1882) di Gaetano Previati. Negli ultimi anni presso il museo sono state allestite mostre temporanee, o esposizioni di singoli capolavori in trasferta, con notevole successo di pubblico.