Eretta nel 1475-1481 per volere di Sisto IV della Rovere, che le diede il nome, sede di conclavi e cerimonie solenni, conserva eccezionali cicli di affreschi realizzati in tre diverse fasi. L'universale notorietà della Cappella Sistina deriva dal celeberrimo Giudizio Universale, dipinto da Michelangelo tra il 1536 e il 1541: nella grande scena domina Cristo giudice intorno al quale sono la Vergine, i santi, i martiri e i beati; più in alto, sotto gli archi della volta, angeli senza ali portano i simboli della passione (croce, corona e colonna); nella zona centrale gli angeli tubicini suonano le trombe per destare i morti, mentre i dannati vengono spinti con forza all'inferno dove li attende Minosse; le anime dei giusti, alla destra di Cristo, vengono portate verso il cielo dopo la resurrezione della carne. Lo stesso Michelangelo aveva eseguito nel 1508-1512 la decorazione della volta, concepita come un'imponente architettura dipinta, al centro della quale inserire nove storie della Genesi, negli scomparti verticali Profeti e Sibille e, nelle vele e nelle lunette, gli Antenati di Cristo. La decorazione delle pareti laterali risale invece al 1481-1483, con due cicli su soggetti dell'Antico e del Nuovo Testamento: tra questi si segnalano affreschi con episodi della Vita di Mosè, opera del Perugino, Sandro Botticelli, Cosimo Rosselli, Luca Signorelli, Domenico Ghirlandaio.