Il nucleo originario della pinacoteca, risalente al pontificato di Pio VI (1775-1799), contava 118 dipinti. Molti di questi furono inviati in Francia in seguito al trattato di Tolentino (1797) e, caduto Napoleone, solo una parte tornò a Roma grazie all'azione di Antonio Canova. La collezione si accrebbe nell'Ottocento con acquisizioni e fu definitivamente sistemata nell'attuale edificio, fatto costruire da Pio XI tra il 1929 e il 1932 su progetto di Luca Beltrami. La pinacoteca espone dipinti dal Medioevo al XIX secolo, con particolare attenzione al Rinascimento e al barocco. Degni di rilievo il Trittico Stefaneschi di Giotto e aiuti, un affresco di Melozzo da Forlì con Sisto IV, la Madonna di Foligno e la Trasfigurazione di Raffaello, il S. Gerolamo di Leonardo, la Deposizione dalla Croce del Caravaggio, la Crocifissione di S. Pietro di Guido Reni; importanti e celebri anche i dieci arazzi realizzati, tra il 1515 e il 1516, su disegno di Raffaello, detti della Scuola Vecchia. Nelle ultime due sale sono esposte icone bizantine e modelli del Bernini per la Gloria, custodia bronzea della cosiddetta cattedra di S. Pietro.