La più antica istituzione ospedaliera della città - le sue origini si fondono con quelle stesse del Borgo - copre l'intera area compresa tra via de' Penitenzieri, lungotevere in Sassia e borgo S. Spirito, sul quale prospetta la quattrocentesca Corsia Sistina. L’ospedale, già funzionante dal 1204 come istituzione cittadina per la cura degli infermi, dell'infanzia abbandonata e dei poveri, era finanziariamente autonomo e soggetto solo all'autorità papale, con numerose filiazioni in Europa già dal sec. XIII; il più antico regolamento ospedaliero che si conosca (il «Liber Regulae») ne fissava il funzionamento. Ampliato a partire dal Quattrocento con Sisto IV, dal sec. XVIII si è consolidato anche come centro d'insegnamento e ricerca. Alcuni settori del nosocomio costituiscono esempi notevoli di architettura civile rinascimentale; tra questi la Corsia Sistina, costruita forse da Baccio Pontelli nel 1473-78. Lunga circa 120 m, con cortina in laterizio e porticato a pilastri ottagonali murato sotto Benedetto XIV, riveste un notevole interesse come esempio di architettura civile. A metà della Corsia si leva il tiburio ottagonale, in cui grandi bifore si alternano a trifore affiancate da maioliche ottocentesche con stemmi papali. L'arco d'ingresso di Gian Lorenzo Bernini (1664) nasconde il portale di fine '400 attribuito ad Andrea Bregno, inquadrato da lesene scanalate, con capitelli compositi, e dalla trabeazione, con motivo di grifi nel fregio; a sinistra dell'arco esterno ci sono la ruota degli esposti per l'affido anonimo dei neonati e la buca per le elemosine. La facciata verso il fiume è stata ripristinata nel 1926-28, in seguito all'apertura del lungotevere, in forme quattrocentesche che s'ispirano ai pochi elementi superstiti. L’interno è articolato in una serie di cortili attraverso i quali si accede allo splendido vestibolo della Corsia Sistina. Tra le pareti affrescate troneggia il baldacchino dell'altare di S. Giobbe (pala di Carlo Maratta), ricomposto sotto Clemente VIII e attribuito a Palladio (c. 1546). Le due ali della Corsia Sistina sono decorate da circa 1000 m² di affreschi del sec. XV molto anneriti (raffiguranti le origini leggendarie dell'ospedale dal sogno di Innocenzo III e alcuni episodi della vita di Sisto IV) e riconducibili a più artisti, in parte di provenienza umbra. La Sala Alessandrina, ripristinata nel 1931, ospita il Museo storico nazionale dell'Arte sanitaria.