Il primo nucleo di questa superba raccolta, da sempre conservata nell'edificio costruito nel XVII secolo da Giovanni Vasanzio e da altri, si costituì tra il 1605 e il 1633 grazie al cardinale Scipione Borghese. Tra il 1801 e il 1809 Camillo Borghese, marito di Paolina Bonaparte, vendette alla Francia molti quadri (tra cui la Cena in Emmaus del Caravaggio) e oltre 200 sculture antiche. La raccolta venne poi in parte ricostituita e nel 1902 fu acquistata dallo Stato. La galleria, riaperta al pubblico nel 1997 dopo circa 20 anni di restauro, conserva sculture, bassorilievi e mosaici antichi nonché dipinti e sculture dal XV al XVIII secolo. Si segnalano, tra i tanti capolavori, il Ritratto d'uomo di Antonello da Messina (circa 1473), Madonna col Bambino di Giovanni Bellini, la Deposizione di Raffaello (1507), Amor Sacro e Amor Profano di Tiziano (1514), Danae del Correggio (XVI secolo), Giovane con canestro di frutta (1593-1595), Madonna dei Palafrenieri (1605-1606) del Caravaggio, le sculture di Gian Lorenzo Bernini e la Paolina Borghese come Venere di Antonio Canova (1805).