Tra le più importanti del barocco romano, e chiesa della nazione lombarda a Roma, venne commissionata nel 1610 (l'anno della canonizzazione di S. Carlo Borromeo) a Onorio e Martino Longhi il Giovane, per poi essere ultimata nel 1668-69 da Pietro da Cortona, cui si devono il completamento della tribuna, la cupola e il disegno della decorazione a stucchi all'interno. Notevole per l'ampia e slanciata spazialità, è a tre navate con volta a botte e tre cappelle per lato, a cui sono allineati i bracci del transetto dominato dalla cupola; intorno al profondo presbiterio absidato si sviluppa, in prosecuzione delle navate laterali, un deambulatorio, unico a Roma ed evidente richiamo di quello gotico del Duomo di Milano. La ricchissima decorazione tardo-barocca non prevale sulla struttura ma ne costituisce la parte integrante: gli stucchi della volta centrale, del transetto e della tribuna furono eseguiti da Cosimo e Giacomo Antonio Fancelli su disegno del da Cortona. Sull’altare maggiore: Gloria dei Ss. Ambrogio e Carlo, preziosa pala di Carlo Maratta (1685-90) restaurata nel 1831 da Vincenzo Camuccini. Nel deambulatorio, in una nicchia dietro l'altare, ricco reliquiario del cuore di S. Carlo. Nell'antisagrestia, una notevole Crocifissione del Borgognone.