Il museo documenta l'antica strada che congiungeva Roma a Ostia ed è allestito nei locali di Porta S. Paolo, fondata nel III secolo, che conserva i due fornici originari dai quali si dipartivano la Via ostiense e l'antica Via laurentina. Sono esposti calchi di iscrizioni e rilievi relativi al percorso e ai monumenti della via, plastici, tra i quali quelli di Ostia e dei porti di Claudio e di Traiano. Completano la documentazione piante antiche e moderne, stampe e fotografie. In una stanza, che reca ancora traccia di affreschi medievali, sono raccolte le memorie cristiane della Via ostiense e di Ostia nonché pezzi provenienti da catacombe