Istituito nel 1852, occupa i piani superiori del Palazzo comunale, dove si ammirano opere dal XII al XVI secolo, tra cui spiccano affreschi di Lippo Memmi (come la Maestà del 1317, replica del celebre affresco di Simone Martini nel Palazzo pubblico di Siena) e dipinti di Coppo di Marcovaldo, del Pinturicchio, di Taddeo di Bartolo, Benozzo Gozzoli. Di straordinaria bellezza i due tondi (Angelo annunciante e Vergine annunciata) dipinti da Filippino Lippi nel 1482. È inoltre possibile accedere alla Torre Grossa, la più alta di San Gimignano, da dove si gode uno stupendo panorama.