Il percorso museale, su tre livelli e con oltre 110 sale, parte dal piano nobile e ripropone la stessa collocazione voluta da Carlo di Borbone per i capolavori dei Farnese, oltre 200 dipinti ordinati cronologicamente e per scuole; li accompagnano gli arredi dell'Appartamento reale, le collezioni Borgia e De Ciccio e la Galleria delle Porcellane. Al secondo piano, la Galleria della Pittura a Napoli dal XIII al XVIII secolo e la Sala degli Arazzi della Battaglia di Pavia, mentre al terzo piano si trovano la Galleria dell'Ottocento, la collezione fotografica e la parte principale della sezione di Arte contemporanea, con opere espressamente eseguite per il museo. Le collezioni del primo piano raccolgono capolavori di arte pittorica italiana ed europea dal '400 al '700, con opere, tra gli altri, di Tiziano, Raffaello, El Greco, Correggio, Parmigianino, i Carracci. Tra queste il ritratto di Paolo III e Paolo III coi nipoti Ottavio e Alessandro Farnese, opera eccezionale per la caratterizzazione fisiognomica e psicologica dei personaggi. Estranea alla collezione Farnese, ma di inestimabile valore, è la Crocifissione di Masaccio, acquistata dal museo nel 1901. Dei quattro cartoni farnesiani esposti, due portano la firma di Raffaello e Michelangelo: rispettivamente Mosè davanti al roveto ardente e Gruppo di soldati. Bellissimi esempi di arte toscana sono la Madonna col Bambino del Perugino e la Madonna col Bambino e angeli del Botticelli. Alla collezione Borgia (acquisita nel 1817) appartengono dipinti del '300 e '400, tra cui la S. Eufemia e il ritratto del cardinale Gonzaga di Andrea Mantegna. Seguono opere di pittori veneti dei secoli XV e XVI, come la Trasfigurazione di Giovanni Bellini, tra i massimi capolavori della maturità. Studi e ricerche sulla luce trapelano anche dalle tre tele di Tiziano e nel magnifico gioco di chiaroscuri del Ragazzo che accende una candela di El Greco. Tra le opere di maestri emiliani e ferraresi del XVI secolo spiccano le tele del Correggio e due Ritratti del Parmigianino. L'allestimento della Galleria di Cose rare ripropone quello di un'antica Camera delle Meraviglie: bronzetti rinascimentali e manieristi; il preziosissimo cofanetto Farnese, in argento dorato; medaglie del Rinascimento e altre preziose opere. Nell'Appartamento reale di valore sono le opere legate ai Borbone. Tra gli ambienti il più prezioso è il Salottino di Porcellana, con le pareti rivestite di porcellana. Nella Galleria delle Porcellane è ordinata parte della raccolta di porcellane (si notino le molte opere di F. Tagliolini, 1771-1806). Della collezione De Ciccio, donata allo Stato nel 1958, fanno parte oltre 1300 oggetti d'arte applicata. All'armeria appartengono armature in parte dei membri delle famiglie Farnese e d'Avalos. La galleria delle Arti a Napoli dal '200 al '700 è dedicata alle opere di ambito napoletano perlopiù provenienti da chiese e monasteri soppressi, e dalla collezione della famiglia d'Avalos. Particolarmente importante è la sezione relativa alla pittura napoletana del '600 e '700 con la Flagellazione di Caravaggio e, tra i napoletani caravaggeschi, le tele di J. de Ribera, M. Stanzione, A. Vaccaro e A. Falcone. Di importanza eccezionale per integrità e qualità è la serie di sette grandi arazzi con scene della Battaglia di Pavia. La Galleria dell'Ottocento è costituita da dipinti di grandi dimensioni e da sculture della seconda metà dell’Ottocento (D. Morelli, F. Palizzi, G. Toma). La collezione fotografica introduce all'importante sezione di arte contemporanea; non mancano realizzazioni di Alberto Burri, Sol Lewitt, Mimmo Paladino e Andy Warhol. Di recente allestimento è la nuova sezione dell’Ottocento privato, nell’area meridionale del palazzo al piano ammezzato (V. Gemito, A. Mancini, pittori delle scuole di Posillipo e Resina) e la sezione dedicata ai Manifesti Mele.